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爱波网:MicroRNA sponge沉默miR

2020/5/24 1:06:46 来源:爱波网 阅读次数: 4

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爱波网MicroRNA sponge沉默miR

【摘要】:目的目前治疗IgA肾病的主要药物是糖皮质激素和免疫抑制剂等,但这些药物副作用大,疗效差。

研究及开发能够精准治疗IgA肾病的新药是肾脏领域的研究热点之一。 当前国内外学者对于IgA肾病研究发病机制研究,无论是GWAS还是非编码RNA的研究,都已经取得了许多重大进展。 很多研究表明,IgA肾病的发病机制与机体的基因和非编码RNA的异常密切相关。

然而目前临床使用的药物往往并非针对异常基因本身进行治疗,缺少靶向性和特异性。 有研究发现IgA肾病患者外周血单个核细胞中miR-148b增高导致了糖基化异常IgA1分子的产生,沉默microRNA或可降低糖基化异常IgA1分子的产生。

microRNA海绵(microRNAsponge)作为一种新的技术,可以稳定的沉默microRNA。

基于此,本文通过构建腺病毒介导的microRNAsponge沉默miR-148b,研究该microRNAsponge是否可以用于改善IgA1分子的糖基化缺陷。 方法通过miRbase数据库检索miR-148b成熟序列,根据该成熟序列设计对应的反义序列,并将反义序列上第9-12位碱基进行错配,合成一段含有4个重复反义序列的hsa-mir-148b-3psponge序列,进一步将序列与pMIR载体连接,然后再将连接好的pMIR载体与pAD5/F35腺病毒载体共转染,转染后使hsa-mir148b-3p序列同源重组到腺病毒骨架载体上,最后筛选获得需要的阳性克隆腺病毒分子。 体外培养产糖基化缺陷IgA1分子的DAKIKI细胞株,通过构建腺病毒miR-148bsponge感染细胞株,探讨其改善糖基化缺陷的机制。 实验分为三组:空白对照组(control)、miR-148bscramble组(control-GFP)、miR-148bsponge(miR-148bSP)组。 分别用腺病毒miR-148bsponge转染24、48、72小时后,提取细胞内总RNA,通过RT-PCR检测miR-148b和C1GALT1基因表达。

腺病毒转染72小时后,提取细胞总蛋白,免疫印迹法检测细胞C1GALT1蛋白表达。

分别收集不同时间段细胞上清,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组细胞上清中糖基化缺陷IgA1分子的含量。

结果(1)腺病毒介导的海绵基因miR-148b被成功构建并鉴定;(2)将构建好的腺病毒miR-148bsponge用于转染DAKIKI细胞,通过荧光显微镜观察各组的转染效率,实验组可以检测到较高强度的绿色荧光,表明所构建的腺病毒具有较高的转染效率,可用于下一步实验研究。

(3)实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞中的miR-148b表达水平,结果显示相较于miR-148bscramble组,miR-148bsponge组细胞中miR-148b含量明显降低,同时C1GALT1基因表达水平明显增高。 (4)免疫印迹法检测C1GALT1蛋白的表达水平,相较于miR-148bscramble组,miR-148bsponge组,C1GALT1蛋白表达水平表达增高。 (5)通过酶联免疫吸附实验检测糖基化缺陷IgA1分子的表达水平,miR-148bsponge组糖基化缺陷IgA1表达水平明显组低于实验对照组。

结论本研究成功构建了腺病毒miR-148bsponge,并验证了其可通过沉默miR-148b纠正IgA1分子的糖基化缺陷,为IgA肾病机制研究及其治疗提供新的思路。

【学位授予单位】:武汉大学【学位级别】:硕士【学位授予年份】:2017【分类号】:。

爱波网MicroRNA sponge沉默miR印度4岁小孩远超同龄人,却因长的像小老头子被人鄙视,造成这样的结果,只因为他的父母不听老辈劝告,孩子是父母爱情的结晶,是集一家人宠爱的宝贝,可是这个看起来像老头子的孩子,命运却是因为父母的一意孤行造成的,到底怎么回事呢?一起来看看吧!年仅4岁的他满脸皱纹,面部浮肿,皮肤也像个老头子一样松松垮垮的耷拉在身上,而且还有很严重的关节炎和排尿问题,牙齿也像老人一样松动,牙质也十分脆弱,医生断言他活不过15岁,但是值得庆幸的是,这个孩子十分的聪明,和同龄的小屁孩比起来,他几乎要聪明上几倍。

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